Durchflusszytometrische PNH-Abklärung
Der Goldstandard der PNH-Diagnostik: FLAER-Analyse1-3
In Modul 1 haben Sie bereits den Diagnosealgorithmus kennengelernt.1 Liegen entsprechende Symptome/Hinweise auf eine PNH vor, sollte ein durchflusszytometrisches PNH-Screening durchgeführt werden.
Im Grundlagenkurs haben Sie bereits über die PNH-Abklärung mittels Durchflusszytometrie erfahren, dass sie
- der Goldstandard in der PNH-Diagnostik ist und
- GPI-Anker oder GPI-verankerte Proteine markiert werden.
Die Diagnostik sollte in einem entsprechendem Labor nach ICCS/ESCCA Leitlinien2 durchgeführt werden. Hier bekommen Sie einen Überblick über die Methode, damit Sie in der Lage sind, die Ergebnisse der Diagnostik mittels FLAER zu interpretieren.
Reminder Probenvorbereitung3
Für die Messung benötigen sie peripheres Blut, möglichst EDTA-antikoaguliert. Die Vitalität der Zellen ist für die Aussagekraft der Messung essenziell, daher sollte diese zeitnah erfolgen. Die Leitlinien empfehlen, dass die Messung weniger als 48 h nach der Abnahme erfolgt, maximal 72 h. Bei Transportzeiten über 24 h sollte die Probe gekühlt werden (+1 bis +10°C).
Tipp: Tote und apoptotische Zellen können zu falsch positiven Ergebnissen führen, daher den Zeitraum zwischen Abnahme und Messung so kurz wie möglich halten.1
Welche Zellen sind für die PNH Diagnostik essenziell?
In der folgenden Abbildung sehen Sie verschiedene PNH-relevante Zelltypen, die phänotypisch GPI-verankerte Proteine auf ihrer Oberfläche exprimieren. Die rote Markierung zeigt, bei welchen Zelltypen ein FLAER-Assay möglich ist.3
Das "2 x 2" der PNH-Diagnostik mittels Durchlusszytometrie
- Pro Zellreihe mindestens 2 Marker (GPI-veranbkerte Proteine oder GPI) anschauen (+ Zellpopulation über nicht GPI-verankerten Marker bestimmen)2
- Mindestens 2 Zellreihen anschauen, z. B. Granulozyten und Retikulozyten
PNH-Diagnostik mittels Durchlusszytoemtrie
Das Fehlen der GPI-verankerten Oberflächenmoleküke kann in der Durchflusszytometrie mit FLAER (direkt gegen die GPI-Anker) oder CD55/CD59-Markern gemessen werden (siehe Abschnitt FLAER und Zusammenfassung).
Je sensitiver die Analyse, desto besser?
Bei Patient:innen mit aplastischer Anämie ist eine hohe Sensitivität zur PNH-Abklärung essentiell.1 Für Routineuntersuchungen reicht dagegen ein Anteil von 1 %, da auch in der Allgemeinbevölkerung sehr kleine PNH-Klone detektiert werden können, ohne dass eine symptomatische PNH vorliegt oder die Gefahr einer Expansion des PNH-Klons besteht.1
Der FLAER-Assay3
Bei dem FLAER-Assay wird Aerolysin als Bindemolekül eingesetzt. Aerolysin ist ein Toxin aus Aromonas hydrophilia und bindet hochspezifisch an die GPI-Moleküle auf weißen Blutzellen. FLAER steht für "Fluorescence-labeled proaerolysin", da hier inaktiviertes, nicht toxisches, mit Fluorochrom konjugiertes Aerolysin zur Anfärbung von GPI genutzt wird. Nach dessen Bindung kann die Fluoreszenz entsprechend mittels Durchflusszytometer detektiert und quantifiziert werden.
PNH-Klon: Typ I, Typ II, Typ III Zellen1,3
Nach der Analyse erhalten Sie einen Befund. Bei der FACS-Analyse werden die einzelnen Zelltypen durch fluoreszenzmarkierte Antikörper und anhand von Größe und Streulicht unterschieden. So kann man z. B. spezifisch rote Blutkörperchen anschauen, wie exemplarisch in der folgenden Abbildung.
Durchflusszytometrische Analyse des PNH-Klons
Das Fehlen der GPI-verankerten Oberflächenmoleküke kann in der Durchflusszytometrie mit FLAR (direkt gegen die GPI-Anker) oder CD55/CD59-Markern gemessen werden (siehe Abschnitt FLAER und Zusammenfassung).
Das Fehlen der Oberflächenmoleküle kann in der Durchflusszytometrie mit FLAER (direkt gegen die GPI-Anker) oder mit mittels CD55/59-Markern gemessen werden
>> siehe Plot und Zusammenfassung.
Mit freundlicher Genehmigung von Dahl-Chase Diagnostic Services, USA.
Zusammenfassung PNH-Diagnostik mittels Durchflusszytometrie
Eine geeignete Untersuchung beinhaltet:
- Durchflusszytometrie von peripherem Blut4, 5
- Messung der Granulozyten und mindestens einer weiteren Zellreihe, z. B. Monozyten. Werte für Erythrozyten können abweichen aufgrund der Zerstörung durch die IVH)4, 5
- Verwendung von mindestens zwei Antikörpern zur Detektion GPI-verankerter Proteine (z.B. CD59 und CD55) oder FLAER4, 5
- Sensitivität: 1% bei Routinekontrollen und deutlich höhere Sensitivität bei Patient:innen, mit aplastischer Anämie4
- Klongröße für jede untersuchte Zellreihe4
Referenzen:
- Schubert J., Bettelheim B., Brümmendorf T.H., Höchsmann B., Panse J., Röth A., Schrezenmeier H., Stüssi G., https://www.onkopedia.com/de/onkopedia/guidelines/paroxysmale-naechtliche-haemoglobinurie-pnh/@@guideline/html/index.html (zuletzt aufgerufen Juli 2022)
- Sutherland D.R. et al., Cytometry B Clin Cytom . 2018 Jan;94(1):23-48.
- Brando B. et al., EJIFCC. 2019 Nov 25;30(4):355-370. eCollection 2019.
- Borowitz MJ et al. Clinical Cytometry Society. Cytom B Clin Cytom. 2010;78:211-230.
- Schrezenmeier, H. et al. JLM 2011;35:315-327.